Stanovení glukózy metodou glukózooxidázy

Analýzy

Stanovení koncentrace glukózy v krvi je jednou z nejčastěji prováděných biochemických studií v laboratořích.

Metoda glukózooxidázy pro stanovení glukózy v krvi a moči je založena na reakci oxidace glukózy v přítomnosti enzymu glukózooxidázy s tvorbou peroxidu vodíku, který naopak v přítomnosti peroxidasy oxiduje orthotolidin na barvivo; o Koncentrace glukózy je slibována množstvím barevných produktů.

Vzhledem k tomu, že metoda glukózooxidázy je zaměřena na identifikaci glukózy a nikoliv všech typů cukrů, používá se při diferenciální diagnostice následujících onemocnění:

Princip metody glukózooxidázy pro stanovení glukózy

Glukóza v přítomnosti enzymu glukózooxidázy je oxidována atmosférickým kyslíkem za vzniku peroxidu vodíku během reakce. Peroxid vodíku v přítomnosti peroxidázového enzymu oxiduje ortotoluidin za vzniku barevné sloučeniny, jejíž intenzita barvy je úměrná obsahu glukózy. Tato metoda vám umožňuje určit hladinu glukózy v krevní plazmě, v séru a v mozkomíšním moku.

Normální hladina glukózy v krvi, mmol / l

- v plazmě, v natsheartse

novorozenci - 1,7 - 4,2
děti od 6 týdnů do 15 let - 3,3 - 5,4
dospělí (muži, ženy) - 3,9 - 5,6

- v séru, v natsheartse

novorozenci - 2.6 - 4.2
děti od 6 týdnů do 2 let - 3,3 - 5,4
dospělí (muži, ženy) - 3,9 - 5,6

Nutná činidla pro stanovení glukózy metodou glukózooxidázy

1. chlorid sodný 9 gramů / litr (izotonický roztok): připravený rozpuštěním 0,9 g chloridu sodného ve 100 ml vody.

2. Síran zinečnatý, 50 g / l: 5 g síranu zinečnatého (ZnS04) se rozpustí ve vodě a objem se upraví na 100 ml.

3. Hydroxid sodný 0,3 mol / l: připravený rozpuštěním 1,2 g NaOH ve 100 ml vody, koncentrace se kontroluje titrací (měla by být 0,3 n).

4. Ortotoluidin, 1% roztok: 1 g léčiva se rozpustí ve 100 ml absolutního alkoholu. Roztok lze uchovávat v chladničce v baňce se skleněnou zátkou po dobu několika měsíců. Komerčně dostupný produkt může být čištěn rekrystalizací, pro kterou je rozpuštěn v absolutním alkoholu, přidána voda a vysrážené krystaly jsou odsány na filtr a poté sušeny přes chlorid vápenatý.

5. Acetátový pufrovací roztok pH 4,8: smísí se 4 díly 0,25 n kyseliny octové (kontrola titrací) a 6 dílů 0,25 n octanu sodného (obsahuje 34 g CH3COONa X 3H2O v 1 litru).

6. Glukóza oxidáza je suchý přípravek s aktivitou 3000 jednotek / mg nebo více.

7. Křenová peroxidáza. 1 mg se rozpustí v 5 ml acetátového pufru, může být skladován v chladničce několik dní.

8. Pracovní činidlo: rozpusťte 2 mg glukózooxidázy a 1 mg peroxidázy v 80 ml acetátového pufru, přidejte 1 ml 1% roztoku ortotoluidinu, promíchejte a přeneste objem na 100 ml pufru. Pracovní činidlo musí být průhledné, bezbarvé nebo má slabý zelený odstín, v tomto případě je při skladování v chladu stabilní. Pokud je barva intenzivní nebo po několika hodinách po přípravě začne srážet, znamená to, že ortotoluidin není dostatečně čistý a musí být rekrystalizován.

9. Kalibrace roztoků glukózy. Glukóza se předem suší při 37 ° C a uchovává se v exsikátoru. Nejprve připravte zásaditý roztok s koncentrací 50 mmol / l, pro kterou se 180 mg látky rozpustí ve 20 ml nasyceného roztoku kyseliny benzoové (přibližně 0,3%). Z tohoto roztoku připravte pracovní kalibrační roztoky obsahující 3; 6; 9; 12; 15; 18 a 21 mmol / l, pro které užívají 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 a 4,2 ml bazického roztoku a přivede se nasycený roztok kyseliny benzoové na objem 10 ml. Tyto roztoky obsahují glukózu ve stejných koncentracích, jaké se vyskytují v krvi, což usnadňuje výpočty během kalibrace.

Průběh stanovení glukózy metodou glukózooxidázy

V centrifugačních zkumavkách přidejte 1,1 ml roztoku chloridu sodného, 0,4 ml roztoku síranu zinečnatého a 0,4 ml 0,3 n roztoku NaOH, promíchejte; současně se vytvoří velmi tenký gel hydroxidu zinečnatého, do něj se uvolní 0,1 ml krve nebo kalibračního roztoku, opět se promíchá a po 10 minutách odstředí rychlostí 3000 otáček za minutu po dobu 10 minut.

K 1 ml supernatantu se přidá 3 ml pracovního činidla a mírně se promíchá.

Postupně se začíná vyvíjet barva, která při normální pokojové teplotě dosáhne maxima po 13-15 minutách a pak se postupně snižuje. Fotometricky vždy po stejném časovém období po přidání pracovního činidla do kyvety s délkou optické dráhy 1 centimetr s červeným světelným filtrem (vlnová délka 625 nm) proti nečinnosti, který je nastaven současně s pracovními vzorky, ale namísto krve, proveďte fyziologický roztok chloridu sodného.

Při přípravě kalibračního grafu se namiesto vzorků krve odebere 0,1 ml odpovídajícího kalibračního roztoku.

Výpočet glukózy se může provádět podle proporcionálního pravidla nebo kalibračního plánu, aby se vytvořila koncentrace glukózy (mmol / l) na jedné ose a extinkční hodnota na druhé.

Poznámky k metodě stanovení glukózy metodou glukózooxidázy

1. Nejdříve můžete uvolnit krev z pipety do isotonického roztoku chloridu sodného a potom přidat roztoky síranu zinečnatého a NaOH.

2. Při systematické práci není zapotřebí neustále vytvářet kalibrační plán pro všechny body, stačí zpracovat slepý vzorek a 2-3 body v rozmezí 3-9 mmol / l denně a sestavit kompletní kalibrační plán pouze při změně reagencií nebo úpravě postupu.

Metoda glukózooxidázy pro stanovení glukózy

Metoda glukózooxidázy se používá k určení koncentrace glukózy výhradně v různých tělesných tekutinách. Výhodou tohoto testu je jeho přesnost. Diagnostika, na rozdíl od rychlých metod, dovoluje odhalit množství čisté glukózy, bez fruktózy a jiných cukrů. Princip této reakce je zbarvení roztoku, který vzniká v důsledku interakce oxidačních činidel se specifickými barvivy. Hodnocení výsledků výzkumu se provádí metodou kolorimetrie a srovnáním se standardními roztoky.

Kdy je předepsána metoda glukózooxidázy?

Tento test se používá k detekci poruch tolerance cukru a vzniku pre-diabetes, stejně jako u výskytu onemocnění. Analýza se však zřídka používá k takovým účelům, což je způsobeno vysokými náklady a dlouhým očekáváním výsledku. Nejčastěji se zjišťuje stanovení glukózy v krvi a moči pomocí této metody v diferenciální diagnostice onemocnění, jako jsou:

syndrom intolerance laktózy;
intolerance fruktózy;
uvolňování fruktózy pomocí tělesných tekutin;
zvýšená koncentrace pentózy v moči.

Nespornou výhodou testu glukózooxidázy je její přesnost.

Jaký je základ této metody?

Existují různé metody pro stanovení koncentrace glukózy v krvi, ale nejpřesnější je glukóza oxidasa. Důsledkem je, že interakce cukru s kyslíkem ve vzduchu oxiduje činidlo. Do roztoku se uvolňuje peroxid vodíku. Tato látka interaguje s orthotoluidinem, čímž vzniká barevná sloučenina. Chování této reakce vyžaduje přítomnost speciálních enzymů. V oxidační reakci musí být přítomna glukózaoxidasa a peroxidáza při barvení kapaliny. Intenzita barvy roztoku bude záviset na obsahu glukózy a bude mít nejvyšší intenzitu s vysokým obsahem.

Podstata metody glukózooxidázy pro stanovení glukózy

Hodnocení výsledku probíhá za použití kvantitativní metody fotometrie ve stejném časovém intervalu. Ujistěte se, že používáte kalibrační roztok, který obsahuje určitý poměr cukru, a od toho můžete hodnotit koncentraci glukózy v tělních tekutinách, často v krvi.

Jak se provádí analýza?

Materiál je odebrán od pacienta na prázdný žaludek. Pro test s použitím žilní krve v množství 5 ml. V předvečer diagnózy je pacientovi prokázána přísná strava. To umožní posoudit spolehlivost výsledku a vyloučit případné chyby analýzy. 2 dny před stažením krve se musí pacient vzdát špatných návyků pití a kouření. Je také nutné omezit příjem nadměrně sladkých pokrmů a pokud je to možné, vyhnout se stresovým situacím.

Nejčastěji se tento způsob stanovení koncentrace glukózy provádí metodou centrifugace, která se používá k oddělení tvarových prvků. Množství cukru se stanoví v plazmě. Po přidání všech nezbytných činidel se po 20 minutách pozoruje barva, pokud se zkouška provádí při pokojové teplotě. Výpočet hladiny glukózy se provádí podle kalibračního plánu nebo podle pravidla porce.

Reagencie pro výzkum

K určení cukru je nejvhodnější použít rychlé metody pro stanovení glukózy v krvi. To je způsobeno snadným používáním a rychlými výsledky. Pacient navíc nemusí chodit do laboratoře nebo nemocnice. Ale na rozdíl od testu glukózooxidázy je taková diagnóza nespolehlivá. Protože nerozlišuje glukózu od ostatních cukrů a určuje jejich koncentraci dohromady.

Základem reakce glukózooxidázy je 9% roztok chloridu sodného a 50% síran zinečnatý. Přidávají se ve fázi centrifugace krve. Kromě toho použijte pufrový roztok s kyselinou octovou a octanem sodným. Titrační metoda určuje jeho pH na 4,8. Poté se přidá glukóza oxidáza, která způsobuje peroxid vodíku a peroxidázu, která se podílí na barvení roztoku na požadovanou koncentraci, aby se získal přesný výsledek.

Normy během analýzy

Množství cukru se měří ve speciálních jednotkách - milimolů na litr roztoku.

Krevní testy na bázi glukózaoxidázy se musí provést na prázdném žaludku a pro tuto skutečnost se používá plazma nebo sérum. Míra počtu dospělých osob pro ženy i muže je 3,3-5,5. Pro děti do 15 let je tato hodnota mírně nižší a pohybuje se mezi 3,2 a 5,3. U novorozenců je hladina glukózy v krvi 1,7-4,2. Zvýšení výkonu je pozorováno při vývoji pacienta s diabetes mellitus nebo porušení glukózové tolerance. Tato podmínka je pre-diabetes, a pokud není léčena včas, pak brzy povede k rozvoji této závažné patologie.

Číslo práce: 1. KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ GLUKÓZY V KRVI. ENZYMATICKÁ (GLUCOSOOXIDÁLNÍ) METODA

ODŮVODNĚNÍ PRO VÝKON PRÁCE. Stanovení glukózy v celé krvi nebo plazmě se provádí u každého pacienta za účelem posouzení stavu metabolismu sacharidů a diagnostiky patologie (hyperglykemie, hypoglykémie). Pro stanovení obsahu glukózy v krvi se používá enzymatické metody založené na oxidaci glukózy oxidázou glukózy na kyselinu glukonovou v přítomnosti kyslíku. Metoda je vysoce specifická pro stanovení D-glukózy v přítomnosti dalších redukčních látek obsažených v tkáňových extraktech a biologických tekutinách.

PRINCIP METODY. Glukóza oxidáza je komplexní enzym obsahující FAD jako protetickou skupinu. Když je glukóza oxidována oxidázou glukózy, dva vodíkové atomy se oddělí od prvního atomu uhlíku v molekule glukózy. Dále jsou tyto dva atomy vodíku přeneseny do FAD, tvoří se FADH₂. Ten druhý přenáší atomy vodíku na molekulární kyslík za vzniku H₂Oh₂. Pak H₂Oh₂ je štěpen enzymem peroxidasy do vody a atomového kyslíku, který oxiduje chromogen (barvivo), který se během oxidace zbarví.

Metoda glukózooxidázy

Dnes jsou nejčastěji používány metody založené na použití enzymu glukózooxidázy. Metoda vychází z následující reakce:

Glukóza oxidáza katalyzuje přenos dvou atomů vodíku z prvního atomu uhlíku glukózy na kyslík rozpuštěný v kapalném reakčním činidle. Během reakce se vytvoří peroxid vodíku v ekvimolárních množstvích. Tedy koncentrace peroxidu vodíku se přesně rovná stanovené koncentraci glukózy. V důsledku toho použití reakce glukózooxidázy přeměnila problém určení koncentrace glukózy na problém stanovení koncentrace peroxidu vodíku, který, jak bude ukázáno níže, je mnohem jednodušší než první. A zde existuje několik metod, které jsou dnes v laboratorní praxi široce používány (viz diagram).

Mezi výše uvedené metody záznamu nejčastěji fotometrické biochemických metod, ve kterých molekuly peroxidu vodíku enzymem peroxidázou štěpí za vzniku aktivní formy kyslíku - superoxidový anion radikál - O₂ -, který zase oxiduje chromogen, což vede k významné změně absorpčního spektra chromogenu.

Vysoká popularita této metody pro stanovení glukózy je způsobena vysokou specifičností a snadnou implementací. Metoda může být provedena pomocí konvenčního fotometru, stejně jako pomocí automatických biochemických autoanalyzátorů.

Metoda glukózooxidázy je dnes uznávána jako jedna z nejpřesnějších kvantitativních metod pro stanovení glukózy. Jako biologický materiál se používá jako sérum a celá krev. Při práci s touto látkou je třeba vzít v úvahu skutečnost, že při podání kapilární krve závisí podíl séra (plazmy) na hodnotě hematokritu, což může negativně ovlivnit přesnost výsledku. Proto je při určování glukózy výše popsaným způsobem výhodné použít sérum pacienta.

Spolu s fotometrickou metodou koncového bodu se před několika lety objevily soupravy, v nichž byla implementována kinetická fotometrická metoda. Podstata metody spočívá v tom, že při určitém poměru aktivit glukózooxidázy a peroxidázy bude rychlost tvorby barevné sloučeniny po určitou dobu po přidání vzorku do pracovního roztoku úměrná koncentraci glukosy ve vzorku. Výhoda této metody spočívá v tom, že výsledek nezávisí na přítomnosti dalších sloučenin ve vzorku, protože jejich absorpce je stabilní v průběhu času. Tato metoda vyžaduje použití kinetického fotometru, poloautomatických analyzátorů nebo automatických biochemických analyzátorů. Měření koncentrace glukózy z plné krve se obvykle provádí pomocí přístrojů, jejichž provoz je založen na amperometrickém principu měření pomocí speciálních enzymových senzorů. Peroxid vodíku je extrémně nestabilní chemická sloučenina a může sloužit jako zdroj nabitých částic. To je to, co se používá u enzymových senzorů typu membrány nebo v elektrochemických prvcích přenosných glukometrů.

Závěrem bychom se měli zmínit o nevýhodách metody glukózooxidázy. Výsledný peroxid vodíku a superoxidový aniontový radikál může oxidovat nejen chromogen, ale také další látky přítomné v biologické tekutině: kyselina askorbová, kyselina močová, bilirubin. Současně klesá podíl peroxidu, který se podílí na oxidaci chromogenu, což vede k podcenění výsledku glukózy. Tato metoda je lineární, zpravidla do 20-30 mmol / l glukózy.

Kvantitativní stanovení glukózy v krvi metodou glukózooxidázy

Princip metody. Metoda je založena na specifičnosti účinku enzymu glukózooxidázy. Tento enzym oxiduje glukosu v přítomnosti molekulárního kyslíku za vzniku glukonolaktonu, který se spontánně hydrolyzuje na kyselinu glukonovou. Glukóza oxidáza oxiduje glukosu za vzniku peroxidu vodíku (H₂Oh₂), který působením peroxidázy reaguje s 4-aminoantipyrinem a fenolem. Výsledkem je růžově zbarvená sloučenina, jejíž optická hustota při 510 nm je úměrná koncentraci glukózy ve vzorku.

2 N₂Oh₂ + 4-aminoantipyrin + fenol → chinonimin + 4H₂Oh

Vybavení: KFK, odstředivka, termostat, stativy, zkumavky, pipety, biologický materiál, činidla obsažená v pracovním roztoku.

zkušební vzorek, ml

standardní vzorek, ml

jediný test (N₂O), ml

Kalibrační roztok glukózy (standardní)

Trubky se inkubují v termostatu při teplotě 37 ° C po dobu 15 minut, poté se kolorimetrují zeleným filtrem v zeleném filtru v kyvetách s tloušťkou vrstvy 5 mm proti polotovaru (H₂O). Růžová barva je stabilní 1 hodinu po inkubaci.

Výpočet obsah glukózy vzorec:

C = standard x, kde

C je obsah glukózy v experimentálním vzorku, mol / l;

Eop je optická hustota vzorku;

Est je optická hustota kalibračního vzorku;

С standard - obsah kalibračního roztoku, mol / l.

Normální hodnoty:  novorozenci - 2,8-4,4 mmol / l

 děti - 3,9 - 5,8 mmol / l

 dospělí - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hypoglykemie (HGH). Zvýšení hladiny glukózy v krvi je způsobeno mnoha důvody, podle nichž existují dvě skupiny hyperglykémie.

1. Insulární - spojený s nedostatečným obsahem v těle inzulínu nebo kvůli neúčinnosti jeho působení.

2. Extrainzulární (extrazulární) - nezávisí na účinku inzulínu.

Následující postupy jsou nejvýznamnější při tvorbě HGH: zvýšené rozložení glykogenu; zvýšená neoglukogeneze; inhibice syntézy glykogenu; snížení využití glukózy v tkáních pod vlivem hormonálních antagonistů inzulínu: somatotropin, glukokortikoidy, thyroxin, thyrotropin.

Potravinářská hyperglykémie je zaznamenána s nadměrným přívodem glukózy v krvi (například hyperglykemie při zatížení cukrem). "Jaterní" hyperglykemie se vyskytuje u difúzních lézí jater.

Trvalá a závažná hyperglykémie nejčastěji doprovází diabetes mellitus. Obvykle se izoluje diabetes mellitus závislý na inzulínu a diabetes mellitus nezávislý na inzulínu, resp. Diabetes mellitus typu I a diabetes mellitus typu II. Tvorba diabetes mellitus typu I je spojena především s narušenou syntézou a výměnou inzulínu.

Druhá skupina hyperglykemie je spojena především s hyperfunkcí endokrinních žláz, které produkují hormony - antagonisty inzulínu. Je pozorován u takových onemocnění, jako je syndrom a Cushingova choroba, akromegalie, tyreotoxikóza, feochromocytom, glukogenom. U některých onemocnění jater se zvyšují hladiny glukózy v krvi (zejména u 10-30% pacientů s cirhózou jater), hemochromatóza (pigmentovaná cirhóza jater, bronzový diabetes).

Hypoglykemie (HGP) - snížení hladiny glukózy v krvi - často spojené s absolutní nebo relativní zvýšení hladiny inzulínu v krvi. Vnepankreaticheskim hypoglykemie pozorovat v důsledku nerovnováhy mezi rozsahem procesy glykogenolýzy a glukoneogeneze v játrech během akutní a chronická hepatitida, cirhóza, akutní a subakutní onemocnění jater, intoxikace alkoholem, otravy arsenem, fosforu, při delším mechanické žloutenky, městnavé jater, primární nebo metastatické rakoviny jater. Snížení koncentrace glukózy v krvi jsou často pozorovány u pacientů s rakovinou jícnu a dalších zhoubných nádorů vnepankreaticheskim lokalizace (fibrom, fibrosarkom, neurom), stejně jako nekontrolovatelné zvracení, anorexie, jaterní diabetes, urémie, bohaté laktace a glykosurie u těhotných žen.

Hypoglykemie může mít centrální původ v důsledku duševního traumatu, encefalitidy, subarachnoidálního krvácení, nádoru na mozku.

1. Dědičná porucha digesce sacharidů.

2. Jaké typy hyperglukózy jsou známy?

3. Jaké jsou příčiny patologické hyperglykosémie?

4. Jaká je příčina inzulín-dependentního diabetes mellitus?

5. Jaké jsou biochemické příčiny dědičných onemocnění: a) glykogenóza? b) aglykogenóza? c) fruktosemie? d) galaktosemie?

6. Jaké jsou biochemické změny metabolismu uhlohydrátů během hladování?

7. Princip metody stanovení tolerance glukózy.

Metody glukózové oxidázy a hexokinázy pro stanovení sérové glukózy v krvi

Přesná diagnóza, předepisová léčba vyžadují řadu laboratorních testů.

Metoda stanovení sérové glukózy je nejdůležitějším nástrojem pro detekci hyper- a hypoglykémie u pacientů s diabetes mellitus.

Metoda umožňuje přizpůsobení metabolických poruch údajů o léčebné terapii. Diagnostické hladiny glukózy lze také stanovit v plné krvi a plazmě.

Metody pro stanovení glukózy v krvi

Metody stanovení množství glukózy v krvi se vyvinuly hodně.

Některé z nich (redukční, kolorimetrické) se prakticky nepoužívají kvůli vysoké toxicitě a nízké přesnosti výsledků.

Nejčastěji používané studie enzymů. Metoda glukózooxidázy je metoda barevné reakce, která nastává při zahřátí sacharidů. Hexokináza určuje aktivitu krve na hexokináze.

Metoda glukózooxidázy

Metoda glukózooxidázy pro stanovení glukózy v krvi je založena na její oxidační reakci pod vlivem enzymu. To vytváří peroxid vodíku, skvrny látka Chromogen, jehož koncentrace určuje množství glukózy.

Metoda glukózooxidázy se používá pro:

dědičná nesnášenlivost fruktózy;
pentozuriu;
laktulózní intolerance.

Nevýhodou studie je, že peroxid vodíku je schopen oxidovat jak chromogen, tak askorb, kyselinu močovou a bilirubin přítomný v krvi. Vypočítejte množství glukózové fotometrické metody, intenzita barvení se porovnává s kalibračním grafem.

V laboratorních podmínkách lze určit hladinu látky:

v žilní krvi. Používají se automatické analyzátory;
v kapilární krvi. Plot se provádí z prstu.

Elektrochemická metoda spočívá v použití elektrod obsahujících glukózooxidázu. Je určeno množství vytvořeného peroxidu vodíku nebo zbývající množství kyslíku spotřebovaného během oxidačního procesu.

Hexokinázová metoda

Látka je nejdůležitějším enzymem metabolismu glukózy, který omezuje rychlost procesu v buňkách.

V laboratorních podmínkách se pod působením hexokinázy glukóza fosforyluje adenosintrifosfátem.

V důsledku reakce se vytvářejí organické molekuly, jejichž množství je určeno úrovní absorpce světla v ultrafialové zóně. Příliš rychlá pozitivní reakce hexokinázy může být také známkou výskytu maligních nádorů.

Příprava na analýzu

Testy glukózy v krvi jsou předepsány pro:

Před analýzou je třeba dodržet řadu podmínek, aby výsledky byly co nejspolehlivější:

výzkum se provádí na prázdném žaludku. Materiál pořízený ráno;
několik dní před diagnózou je nutné vyhnout se těžké fyzické námaze, stresu;
V denní stravě pacienta musí být nejméně 150 gramů uhlohydrátů. Při nedostatku se hladina glukózy zvýší a pomalu klesá, což zkresluje analýzu dat;
den před diagnózou nemůže kouřit a pít alkoholické nápoje;
není možné provádět výzkum po těžkých operacích, porodu, za přítomnosti zánětů. Kontraindikace při analýze jaterní cirhózy, exacerbace žaludečních onemocnění, nádorových procesů;
několik dní před zahájením studie by nemělo být podstupováno fyzioterapeutické postupy, užívat perorální antikoncepci, diuretika, psychotropní léky, kofein.

Analýza může poskytnout falešně pozitivní výsledek u hypokalémie a endokrinních onemocnění (Cushingův syndrom, tyreotoxikóza).

Normy glukózy v krevním séru podle věku

Normální indikátory závisí na věku:

pupočníková krev může obsahovat od 2,5 do 5,3 mmol / l;
u předčasně narozených dětí - od 1,1 do 3 mmol / l;
děti prvního dne života - od 2,22 do 3,33;
ve věku 2,7 až 4,4;
u dětí starších 6 let - od 3,3 do 5,5 mmol / l;
u dospělých do 60 let - od 4,4 do 6,3;
u starších pacientů - od 4,6 do 6,1 mmol / l.

Hypoglykemie u dospělých je diagnostikována s hodnotami glukózy nižšími než 3,3 mmol / l a hyperglykemií - více než 6,1 mmol / l.

Metoda glukózooxidázy pro stanovení glukózy v plazmě

Rádi Vás přivítáme na stránkách www.unimedao.ru!

Děkujeme za odpověď na naši otázku.

19.1.2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Z archivu novin "News A / O Unimed"

Stanovení koncentrace glukózy v krvi je jednou z nejčastěji prováděných biochemických studií v QDL. Důvodem pro výjimečnou popularitu testu je vysoká incidence diabetu. Tento test se provádí jak na lůžkových, tak ambulantních klinikách. Pacienti s diabetem jsou nuceni vyšetřit hladinu glukózy v krvi doma, protože bez těchto informací je pro ně obtížné přizpůsobit stravu, cvičení, užívání inzulínu a jiných antidiabetik. Výjimečný význam testu a velké objemy provedeného výzkumu stimulují vývojáře k vytvoření různých typů zařízení a metod pro stanovení koncentrace glukózy v krvi.

V současné době existuje mnoho metod pro stanovení glukózy. Mohou být klasifikovány následovně.

Metody pro stanovení glukózy v séru

- koncový bod fotometrický

- reflexní fotometrie - suchá chemie

První dvě metody jsou nesmírně nepohodlné, toxické a mají nízkou přesnost, takže se na ně nebudeme zabývat.

Metoda glukózooxidázy

Dnes jsou nejčastěji používány metody založené na použití enzymu glukózooxidázy. Metoda vychází z následující reakce:

Na obr. Obrázky 1 a 2 ukazují spektra pracovního roztoku před a po přidání standardního roztoku glukózy. Maximální absorpce reakční směsi - (činidlo + glukosa) je v oblasti 500 nm. Proto je změna optické hustoty konečné reakce při vlnové délce 480-520 nm úměrná koncentraci glukózy obsažené ve vzorku.

Vysoká popularita této metody pro stanovení glukózy je způsobena vysokou specifičností a snadnou implementací. Metoda může být provedena pomocí konvenčního fotometru (lepší než specializovaný biochemický fotometr, jako je Mikrolab 540) nebo pomocí automatických biochemických autoanalyzátorů.

Spolu s fotometrickou metodou koncového bodu se před několika lety objevily soupravy, v nichž byla implementována kinetická fotometrická metoda. Podstata metody spočívá v tom, že při určitém poměru aktivit glukózooxidázy a peroxidázy bude rychlost tvorby barevné sloučeniny po určitou dobu po přidání vzorku do pracovního roztoku úměrná koncentraci glukosy ve vzorku. Výhoda této metody spočívá v tom, že výsledek nezávisí na přítomnosti dalších sloučenin ve vzorku, protože jejich absorpce je stabilní v průběhu času. Tato metoda vyžaduje použití kinetického fotometru, například Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, poloautomatické analyzátory, jako je Clima 15 nebo automatické biochemické analyzátory. Měření koncentrace glukózy z plné krve se obvykle provádí pomocí přístrojů, jejichž provoz je založen na amperometrickém principu měření pomocí speciálních enzymových senzorů. Peroxid vodíku je extrémně nestabilní chemická sloučenina a může sloužit jako zdroj nabitých částic. To je to, co se používá u enzymových senzorů typu membrány nebo v elektrochemických prvcích přenosných glukometrů.

Vzorek plné krve (obvykle 20 μl) se zředí systémovým pufrovým roztokem (červené krvinky jsou zničeny) a pak vedeny potrubím do průtokové buňky. Glukóza podléhá oxidaci pod vlivem enzymu glukózaoxidázy, který se nachází na membráně. Výsledný peroxid vodíku difunduje přes membránu a je dále oxidován v katalytické reakci za působení platiny. Difúze peroxidu vodíku na povrchu platiny tvoří proud úměrný počtu molekul H₂Oh₂. Takto získaný signál je zpracováván zařízením při odpovídající hodnotě napětí. Tato naměřená hodnota je úměrná koncentraci glukózy ve vzorku.

Jako příklad nástrojů, které používají výše popsanou metodu, můžeme zmínit Biosen glukózové analyzátory (Německo). Tato zařízení jsou vhodná nejen pro použití v nemocnicích, ale i v polyklinikách, kde se testování glukózy provádí hlavně z kapilární krve.

Důležitým krokem ve vývoji klinických laboratorních diagnostických metod byl vznik "suché chemie". Přirozeně bylo jedním z prvních aplikací této technologie stanovení glukózy v krvi pacienta. První přístroje byly ve srovnání s tradičními metodami laboratorního výzkumu výrazně horší. Časem se však podařilo vyvinout takové diagnostické proužky a reflexní fotometry, které poskytovaly velmi vysokou přesnost analýzy. Jednodotykové glukomery a testovací proužky Life Scan (USA) jsou velmi populární po celém světě. Úspěšně spojují analytickou přesnost kvantitativní enzymatické metody s rychlostí a jednoduchostí "suché chemie".

Měřící glukometry One Touch jsou navrženy tak, aby rychle a přesně měřily hladinu glukózy v celé krvi. Testovací proužek One Touch obsahuje všechny nezbytné chemické komponenty pro dvoustupňovou metodu glukózooxidázy, včetně enzymů glukózooxidázy a peroxidázy, které jsou adsorbovány na unikátní porézní hydrofilní membránu. Výsledkem reakce je tvorba barevného komplexu. Intenzita rozvinuté barvy je zaznamenána pomocí reflexního minifotometru.

Membránový testovací prvek One Touch se podobá houbě s mikroskopickými póry a má trojitou funkci. Účinkuje: 1) jako zásobník, shromažďuje požadované množství krve, 2) jako filtr, blokuje pevný buněčný materiál (erytrocyty, leukocyty atd.), 3) jako hladký optický povrch, na němž se měří odražené světlo. Tato funkce je zejména důležitá pro provoz zařízení. Umožňuje číst spodní část pásky, zatímco krev zůstává na horní části testovacího proužku. Proto není potřeba vypláchnout (potlačit) krev z povrchu testovacího proužku.

Kromě toho má membrána hydrofilní vlastnosti, díky níž kapka krve "přitahuje" na povrch testovacího proužku, když se dotýká.

Přístroj One Touch obsahuje dvě speciální LED diody. Zpracování vyvíjené barvy na zkušebním proužku je následující. Jakmile je testovací proužek vložen do přístroje, dojde k nulovému čtení. V tomto okamžiku na displeji vidíme: "ČEKAT". Když se na testovací proužku aplikuje kapka krve, krevní plazma je okamžitě absorbována membránou, zatímco erytrocyty a nadbytečná plazma zůstávají na povrchu membrány. Po úplné absorpci kapky krve se okamžitě objeví barvení. Zařízení zaznamená změnu velikosti reflexe a automaticky spustí časovač. Po 45 sekundách končí chemická reakce a zpracovává se výsledek odrazu světla. Barevný reakční výrobek absorbuje světlo vyzařované první diodou LED. Krevní buňky a přebytečná plazma také absorbují světlo vyzařované diodou. Pro korekci odrazu pozadí je druhé čtení provedeno druhou LED diodou s jinou vlnovou délkou. Rozdíl mezi signály z první a druhé diody LED nese informace o absorpci světla chromogenem. Signál získaný z chromogenu pro odhad koncentrace glukózy je korelován se speciální kalibrací. Všechna zařízení One Touch jsou kalibrována pomocí referenční metody na laboratorním analyzátoru glukózy. Tímto postupem se získá standardní kalibrační křivka. Je třeba poznamenat, že je velmi obtížné stanovit výrobu testovacích proužků, které by byly absolutně stejné chemicky, kvůli velmi nízké koncentraci činidel. K vyřešení tohoto problému je použita standardní kalibrační křivka sestávající z 16 kalibračních linek. Kontrola kvality se provádí okamžitě po výrobě zkušebních proužků, což umožňuje zjistit, která z kalibračních linek (od 1 do 16) mohou být aplikována na tento testovací proužek. Jedná se o tzv. Kódové číslo, které je připevněno na balení testovacích proužků. Tyto 16 kalibračních linek jsou také naprogramovány v mikroprocesoru přístrojů. Pro získání optimálně přesných výsledků je kódové číslo uvedené na obalu testovacího proužku nastaveno v přístroji pomocí kódového tlačítka. Nesprávně nainstalovaný kód na přístroji může způsobit chybu měření.

Od nástupu zařízení One Touch na trhu prošly v laboratořích v Rusku, Americe a Evropě velké množství klinických studií. Jedna z těchto studií byla provedena Endokrinologickým vědeckým centrem Ruské akademie lékařských věd na žádost Ruské asociace diagnostiky lékařských laboratoří. Centrum specialisté provedli srovnávací analýzu dvou metod měření hladin glukózy v krvi. Výsledky získané v aplikaci One Touch byly porovnávány s údaji získanými na biochemickém analyzátoru Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), který implementuje metodu hexokinázy pro stanovení glukózy. Bylo vyšetřeno 190 vzorků krve z 95 pacientů. Korelační koeficient výsledků byl 0,98641. Variační koeficient v normálním a patologickém rozmezí na měřící jednotce One Touch nepřesahuje 2,5%.

Oficiální zpráva Centra endokrinologického výzkumu ruské akademie lékařských věd uvedla: "Zařízení One Touch mají vysokou přesnost a přesnost, stejně jako širokou škálu měření. Mohou být použity k diagnostice havarijních stavů u diabetu, včetně záchranných týmů, protože tato zařízení jsou nejen spolehlivá, ale také rychle produkují výsledky. "

Hexokinázová metoda

Registrace se provádí při vlnové délce 340 nm při absorpci NADH. Tato metoda je vysoce specifická a nereaguje s jinými složkami krevního séra. Metoda hexokinázy je považována za referenci pro stanovení glukózy. Je zpravidla lineární na 50 mmol / l, což umožnilo široce doporučit pro kliniky s endokrinologickými odděleními.

Z popsané různé metody pro stanovení glukózy mohou zaměstnanci QDL samy rozhodnout o tom, která metoda určení a které zařízení si zvolí:

Metody "mokré" biochemie, prováděné na automatických biochemických analyzátorech, poskytnou potřebám laboratoří velký průzkum analýz.
Analyzátory glukosy typu Biosen vyžadují od obsluhy minimální úsilí, protože jsou plně automatizované a dostatečně produktivní (rychlost od 50 do 200 vzorků za hodinu).
Pro laboratoře s malým počtem studií, stejně jako expresní laboratoře, je vhodný specializovaný biochemický fotometr Mikrolab 540.
Pro týmy nápovědy skrýt pomoc je perfektní řešení - glukometry jako je One Touch.

Takže úkol QDL, který zajišťuje nejen rychlé, ale i vysoce přesné stanovení glukózy, je dnes zcela vyřešitelný.

Krevní glukóza, moč, alkohol

Krevní glukóza je přísně kontrolována.

Kontrola koncentrace glukózy v krvi se provádí nervovými vlivy a hormony.

Nervová regulace

Nervová regulace koncentrace glukózy v krvi je vyjádřena pozitivním účinkem n.vagusu na sekreci inzulínu a inhibičním účinkem sympatického inervace na tento proces. Kromě toho je uvolňování adrenalinu do krve vystaveno sympatickým vlivům.

Hormonální regulace

Hlavními faktory hormonální regulace jsou glukagon, adrenalin, glukokortikoidy, somatotropní hormon na jedné straně a inzulin na straně druhé. Všechny hormony, kromě inzulínu, které ovlivňují játra, zvyšují glykémii.

Inzulin je jediný hormon v těle, který je zaměřen na snížení hladiny glukózy v krvi. S jeho vlivem se glukóza silně vstřebává svaly a tuková tkáň.

Snížení koncentrace glukózy v krvi inzulínem je dosaženo těmito způsoby:

přechod glukózy na buňky - aktivace transportních proteinů GluT4 na cytoplazmatické membráně,
závislost glukózy na glykolýze - zvýšení syntézy glukokinázy, enzymu nazývaného záchyt glukózy, stimulace syntézy dalších klíčových enzymů glykolýzy - fosfofruktokranasa, pyruvát kináza,
zvýšená syntéza glykogenu - aktivace glykogensyntázy a stimulace její syntézy, která usnadňuje přeměnu přebytečné glukózy na glykogen,
aktivace dráhy pentosfosfátu - indukce syntézy glukóza-6-fosfátdehydrogenázy a 6-fosfoglukonátdehydrogenázy,
zvýšená lipogeneze - zapojení glukózy do syntézy triacylglycerolů nebo fosfolipidů.

Mnoho tkání je zcela necitlivá na působení inzulínu, jsou nazývány inzulínem nezávislé. Patří mezi ně nervová tkáň, sklovité tělo, čočka, sítnice, glomerulární ledvinové buňky, endotelové buňky, varlata a červené krvinky.

Glukagon zvyšuje hladinu glukózy v krvi:

zvyšování mobilizace glykogenu prostřednictvím aktivace glykogen fosforylázy,
stimulace glukoneogeneze - zvýšení aktivity enzymů pyruvát karboxylázy, fosfoenolpyruvát karboxykinázy, fruktózy-1,6-difosfatázy.

Adrenalin způsobuje hyperglykémii:

aktivace mobilizace glykogenu - stimulace glykogen fosforylázy,

Glukokortikoidy zvyšují hladinu glukózy v krvi

potlačením přechodu glukózy do buňky,
stimuluje glukoneogenezi - zvyšuje syntézu enzymů pyruvátkarboxylázu, fosfoenolpyruvátkarboxykinázu, fruktózu-1,6-difosfatasu.

Tabulka shrnuje hlavní aspekty hormonálních vlivů:

Aktivace glykogenolýzy v játrech;
Stimulace glukoneogeneze;

Zvýšená glukoneogeneze;
Snížená propustnost membrán na glukózu.

Krevní glukóza v klinické praxi

Více než 90% všech rozpustných nízkomolekulárních glycidů v krvi tvoří glukóza; Kromě toho mohou být v malých množstvích přítomny fruktóza, maltóza, manóza a pentóza av případě patologie galaktóza. Spolu s nimi v krvi obsahuje polysacharidy spojené s bílkovinami.

Zvláště intenzivně je glukóza spotřebována a používána pro různé potřeby tkáně centrální nervové soustavy, červených krvinek, medulla ledvin. Při přechodném metabolismu se glukóza používá k vytvoření glykogenu, glycerolu a mastných kyselin, aminokyselin, kyseliny glukuronové a glykoproteinů. Koncentrace glukózy v krvi je derivátem glykolýzy a oxidace trikarboxylových kyselin v cyklu TCA, glykogeneze a glykogenolýzy v játrech a svalové tkáni, glukoneogeneze v játrech a ledvinách a příjem glukózy ze střeva.

V klinické praxi se obvykle vyšetřují hladiny glukózy v krvi, koncentrace jiných cukrů a glykogenu se používají mnohem méně často. V lidské krvi je glukóza poměrně rovnoměrně rozdělena mezi plazma a tvořené elementy, bylo zjištěno, že obsah cukru ve žilní krvi je 0,25-1,0 mmol / l (v průměru o 10%) méně než v arteriální a kapilární krvi. Definice kyseliny mléčné a kyseliny pyrohroznové, aktivita řady enzymů metabolismu uhlohydrátů, kyseliny sialové a hexuronové, serumukoidy, glykosylovaný hemoglobin a další ukazatele má známou diagnostickou hodnotu.

Obsah glukózy v moči závisí na koncentraci v krvi, i když se vylučuje jak v normální, tak v zvýšené hladině cukru v krvi. Se zvýšením koncentrace glukózy v krvi se překonává tzv. Renální prah (u zdravých lidí leží v oblasti 8,3-9,9 mmol / l) a dochází ke vzniku glukosurie. U arteriosklerotických ledvin s diabetem se zvyšuje práh a glukosurie nemusí být zaznamenána ani při zvýšení koncentrace glukózy na 11,0-12,1 mmol / l.

Metody pro stanovení glukózy v krvi

Metody stanovení glukózy v krvi jsou rozděleny do tří skupin: redukce, kolorimetrická a enzymatická.

Redukční metody (Je třeba mít na paměti, že metody této skupiny poskytují nadhodnocené výsledky (asi o 20-25%), protože krev obsahuje řadu sloučenin, které nesouvisejí se sacharidy, ale mají redukční vlastnosti (kyselina močová, glutathion, kreatinin, askorbová kyselina)):
- Hageorn-Jensenova titrometrická metoda je založena na vlastnostech cukru, které při varu v alkalickém prostředí obnovují draselné soli železa a sinu a sludinového železa. Podle stupně tohoto zotavení se koncentrace cukru v krvi zkoumá titrometrií. Důležitou výhodou metody je nízká cena a možnost použití v libovolné laboratoři;
- na základě redukce nitrobenzenů, například kyseliny pikrové na kyselinu pikramovou;
- metoda založená na schopnosti glukózy snížit měděné soli. Výsledná monovalentní měď působí jako meziprodukt. Oxidovaný vzdušným kyslíkem, obnovuje kyselinu arzen-molybdenovou nebo kyselinu fosforečnou, která slouží jako konečný chromogen.
Kolorimetrické metody. Patří sem:
- Somodžiho metoda - redukční reakce mědi, která je v kompozici mědi-orthronového činidla, na oxid měďnatý. Metoda je namáhavá, vícestupňová, nespecifická a prakticky nepoužívaná;
- Folin-Wu metoda - redukce vínanu mědi na oxid lithia. Metoda je jednoduchá, nevýhodou je nedostatek přísné proporcionality mezi intenzitou získané barvy a koncentrací glukózy;
- stanovení koncentrace glukózy podle Morrise a Roe - dehydratace glukózy působením kyseliny sírové a její přeměna na oxymethylfurfural, který kondenzuje arthronem na modrou sloučeninu. Vyžaduje nejčistší činidla a přísné dodržování konstantní reakční teploty;
- Gultmanova orthotoluidinová metoda při modifikaci Chivarinen-Nikkil, která spočívá v určení intenzity barvení roztoku, k němuž dochází tehdy, když aromatický aminový ortotoluidin interaguje s aldehydovou skupinou glukózy v kyselém prostředí. Tato metoda je přesná a umožňuje přesnější stanovení glukózy.
- Anilinová metoda zachovává citlivost metody orthotoluidinu, ale je ještě přesnější.
Enzymatické metody:
- na základě hexokinázové reakce. Glukóza pod působením hexokinázy je fosforylována ATP, výsledný Gl-6-F v přítomnosti dehydrogenázy obnovuje NADP. Množství tohoto množství je určeno zvýšením absorpce světla v ultrafialové oblasti. Metoda je pro praktické laboratoře příliš drahá.
- na základě oxidace glukózy na kyselinu glukuronovou za použití enzymu glukózooxidázy a tvorby během reakce peroxidu vodíku, které (v různých verzích):
  - chemickými prostředky;
  - s účinkem peroxidázy oxiduje bezbarvý orthotolidin, čímž se změní na zeleno-modrou barvu, přímost závislost barvy na koncentraci glukózy zůstává v rozmezí od 1,1 do 22 mmol / l;
  - v přítomnosti fenolu za účasti peroxidázy, oxiduje 4-aminoantipyrin na barevnou karmínově zbarvenou sloučeninu;
  - v přítomnosti iontů mědi oxiduje fenolftalein na fenolftalein, který je za alkalických podmínek červeně zbarven.
Elektrochemické metody, které používají elektrody obsahující imobilizované enzymy, zejména glukózooxidázu. Reakce je zaznamenána množstvím peroxidu vodíku nebo ztrátou kyslíku spotřebovaného pro oxidaci glukózy.
Diagnostické proužky používající reakci glukózooxidázy a peroxidázy a deriváty benzidinu jako chromogen.

Jako jednotné byly přijaty tři metody: titrometrická metoda Haggedorn-Jensen, ortho-toluidinová metoda a metoda o-tolidin-glukóza-oxidázy.

Stanovení glukózy metodou orthotoluidinu

Zásada

Glukóza při zahřátí orthotoloud v přítomnosti kyseliny sírové dává modrozelenou barvu.