Technologie výroby inzulínu

  • Analýzy

Inzulin je jedním z hormonů produkovaných samotným lidským tělem, konkrétně pankreasem. Porušení sekrece této látky vede k vzniku tak závažného onemocnění, jako je cukrovka. Pro léčbu pomocí syntetického hormonu, který je po dlouhou dobu izolován z pankreasu hospodářských zvířat. Nicméně technologie pro výrobu inzulínu pomocí velmi běžné bakterie - Escherichia coli nebo kvasinkové houby byla používána poměrně dlouho. Použití této metody umožňuje vyhnout se alergickým reakcím způsobeným cizími bílkovinami, které mají nepatrný rozdíl od člověka.

Technologická schéma

Výrobní technologie inzulínu zahrnuje všechny hlavní fáze výroby biotechnologických produktů. Výsledkem je krystalický konečný produkt, který se pak používá k přípravě injekčních roztoků používaných při léčbě těžkého diabetes mellitus typu I a II. Hlavní účinek tohoto hormonu v těle se projevuje poklesem hladiny glukózy obsažené v krvi.

Fáze výroby inzulinu budou následující:

  • Předběžné. Provádí takové operace jako je příprava a čištění vody a vzduchu, čištění průmyslových prostor a sterilizace zařízení, inspekce personálu, zpracování rukou a vydávání sterilních obuvi a oblečení. Také v předběžné fázi se provádí primární chemická syntéza molekulárních řetězců, ze kterých je protein shromážděn. Řetězec A obsahuje 21 aminokyselinových zbytků a řetězec B obsahuje 30 aminokyselin.
  • Příprava živných roztoků a buněčné kultury. Aby živá buňka produkovala potřebnou sloučeninu, je zaveden odpovídající gen. Za tímto účelem se plazmid rozštěpí speciálními enzymy, restriktázami a do nich se do nich šité geny kódující syntézu potřebných sloučenin. Potom se pomocí modifikovaného plazmidu vráti do buňky metodou mikroinjekce.
  • Kultivace buněčné suspenze. Geneticky modifikované buňky se umístí do živného roztoku, který má všechny složky nezbytné pro růst a reprodukci a prochází sterilizací. Kultivace kultury probíhá ve speciálních bioreaktorech, kde se krmí předem vyčištěný vzduch. Pravidelně se do reaktoru přidává určité množství živného roztoku a současně se stáhne stejný objem buněčné suspenze.
  • Přidělování kultury. Separace tekutin a buněčné kultury se provádí sedimentací (sedimentací) ve speciálních sedimentátorech a pak filtrací, což umožňuje zachovat celistvost buněk.
  • Chromatografické čištění látky. Provádí se na vhodném zařízení, přičemž se používají různé metody, zejména čelní, aniontově výměnná a gelová permeační chromatografie.
  • Získání proteinové molekuly. Ve skutečném biotechnologickém stadiu dochází k syntéze nevytvářené molekuly inzulínu. A dvě složky jeho řetězů. Šití se po oxidaci a skládání získaných řetězců, což vede k tvorbě disulfidových můstků.
  • Sušení mrazem ve speciální peci, po které je výsledný krystalický přípravek zkontrolován pro shodu s normou, balen, označen a dodán spotřebiteli.

Naše společnost za příznivých podmínek nabízí hotové výrobní linky, kde je plně dodržována veškerá technologie výroby inzulínu. Díky přesným výpočtům, technické a informační podpoře a personálnímu školení v rámci komplexního programu bude společnost zisková a její produkty budou požadovány.

Indikace inzulínu

Dnes má diabetes postižení více než 400 milionů lidí na planetě, což je asi 8% dospělé populace světa. Podle státního rejstříku trpí diabetes v Rusku více než 3,3 milionu lidí (přibližně 300 tisíc lidí trpí diabetem typu 1 a přibližně 3 miliony lidí trpí diabetem typu 2). Je však nepravděpodobné, že tyto údaje odrážejí skutečnou situaci. Všichni tito lidé, žijící každý den, chápou, že jejich život závisí na inzulínu.

První pokusy o léčbu cukrovky byly provedeny před naší dobou. Starověcí řečtí a římští lékaři pro tuto masáž, gymnastiku, koupele, aromaterapii a mnoho dalšího. V 19. století byla pro diabetiky vyvinutá strava s nízkým obsahem sacharidů. První pokus o léčbu cukrovky s inzulínovými injekcemi byl proveden v roce 1921. Kanadský vědec Frederick Banting se stal prvním člověkem, který používal hormon inzulínu k regulaci diabetu. Měl jen 32 kódů, když obdržel Nobelovu cenu za medicínu. Lék účinně vytvořil a bez vedlejších účinků snížil hladinu glukózy z 28,9 na 6,7 ​​mmol / l. Tato droga dávala naději na život mnoha.

V roce 1869 objevil vědec Paul Langergans skupiny buněk v pankreatu, které byly později pojmenovány po něm "ostrovy Langerhans". Inzulín byl následně izolován z buněk těchto ostrůvků. Inzulin je hormon, který reguluje metabolismus, především uhlohydrátů (cukrů), ale také tuků a bílkovin. U diabetiků v důsledku nedostatečné expozice inzulínem dochází ke komplexní metabolické poruše, zvyšuje sa hladina krevního cukru (hyperglykemie), cukr se vylučuje močí (glykosurií) a v krvoketonech (ketoacidóze) se vyskytují kyselé produkty zhoršeného spalování tuků.

Po objevení inzulínu se mnoho vědců začalo vyvíjet metody čištění tohoto léku, protože nečistoty mají škodlivý účinek na oslabené tělo.

Agilent Technologies je světový lídr v oblasti analytických zařízení. Přístroje pro chromatografickou a spektrální analýzu po dobu delší než jeden rok pomohly vědcům na celém světě řešit zásadní problémy léčiv. Kontrola čistoty inzulínu není výjimkou. Dříve byla pro tyto účely použita klasická kapalinová chromatografie, přičemž se dosáhlo celkem přijatelných výsledků:

Po hodně výzkumu vědci dokázali, že vytvořený inzulínový polypeptid o molekulové hmotnosti asi 6000 je účinně identifikován za použití nejnovějšího vývoje v oblasti vylučovací chromatografie.

Pomocí této nové metody lze porovnat "dobrý inzulin", který byl uložen v doporučených podmínkách a "špatný inzulín". Když byly dva chromatogramy navzájem překrývají, ukázalo se, že v inzulínovém přípravku, který byl skladován za nepříznivých podmínek, byla cílová molekula zničena a namísto toho byly na chromatogramu zjištěny produkty rozkladu.

Vývoj a sjednocení metod analýzy a standardizace inzulinových přípravků pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzní fází (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

Tato disertační práce by měla v blízké budoucnosti jít do knihovny.
Informujte o přijetí

Práce - 480 rublů., Dodání 10 minut, nepřetržitě, sedm dní v týdnu a svátky.

Abstrakt - 240 rublů, doručení 1-3 hodiny, od 10-19 (v době Moskvy), s výjimkou neděle

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Vývoj a sjednocení metod analýzy a standardizace inzulinových přípravků pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie s reverzní fází (RP HPLC): disertace. Kandidát farmaceutických věd: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Místo ochrany: Moskovská lékařská akademie "].- Moskva, 2005.- 139 s.: Il.

Obsah dizertační práce

KAPITOLA 1. Přezkum literatury 11

1. Úloha inzulinu při léčbě diabetes mellitus 11

2. Biosyntéza a biologický účinek inzulinu 12

3. Obecné charakteristiky fyzikálně-chemických a farmaceutických vlastností inzulínu 15

4. Inzulinové přípravky 24

5. Metody výroby, standardizace a kontrola kvality inzulinových přípravků 31

6. Použití HPLC při farmaceutické analýze inzulínu. 46

KAPITOLA 2. Prohlášení o problému 50

KAPITOLA 3. Studium vlivu různých faktorů na chromatografické chování inzulínu za podmínek RP HPLC 56

1. Metody a materiály 57

2. Diskuse o výsledcích 62

2.1. Vliv složení tlumivého roztoku 62

2.2. Účinek koncentrace síranu sodného 68

2.3. Vliv teploty chromatografické kolony 70

2.4. Účinek organického modifikátoru 75

2.5. Vliv délky alkylovy zbytku roubované fáze 80

2.6. Vliv délky chromatografické kolony 80

KAPITOLA 4. Zlepšení farmakologických metod pro analýzu inzulinových přípravků založených na použití RP HPLC 82

1. Výběr optimálních podmínek pro chromatografické stanovení inzulínu a jeho nečistot v léčivých přípravcích 82

2. Metrologické charakteristiky metody 84

3. Použití vyvinuté metodiky pro testování oficiálních inzulínových přípravků 95

KAPITOLA 5. Vývoj metod pro analýzu injekčních dávkových forem izofan-inzulínu založených na metodě HPLC PF

1. Výběr podmínek pro chromatografické stanovení protaminu v dávkových formách isofan-inzulinu 110

2. Studium chromatografických profilů protaminů izolovaných z různých druhů ryb 121

3. Metoda stanovení protaminu v izofan-inzulínových přípravcích 123

4. Validace vyvinuté metodiky 125

Obecné závěry 136

Odkazy 139

Obecné charakteristiky fyzikálně-chemických a farmaceutických vlastností inzulinu

Z chemického hlediska je inzulin malý globulární protein s molekulovou hmotností do 6000 Da. Současně je třeba poznamenat, že inzulín je běžným názvem pro celou rodinu homologních proteinů přírodního a umělého původu se společnou charakteristickou biologickou aktivitou. Proteinová povaha inzulínu byla založena v roce 1928 [52]. Jedná se o bílkoviny, které produkují biuretovou reakci a Pauliho reakci. Struktura inzulinu byla plně založena na počátku 50. let. Základní chemické složení inzulinů různých původů je charakterizováno údaji uvedenými v tabulce 1 [40].

Složení aminokyselin. Většina molekul inzulínu obsahuje 51 aminokyselinových zbytků, mezi nimiž je ve většině známých proteinů nalezeno 17 aminokyselin.

Charakteristickým znakem aminokyselinového složení bovinního, prasečího a lidského inzulínu je tryptofan a methionin. Aminokyselinové složení těchto typů inzulinu je uvedeno v tabulce 2 [40,46].

Invariantní vůči všem druhům inzulinu je obsah cystinu (6 zbytků polikystinu). Navíc molekula inzulínu všech typů obsahuje 6 amidových skupin (asparagin, glutamin).

Po uvolnění inzulínu spolu s hlavní frakcí mohou být pozorovány frakce deamidovaných forem inzulínu. V kyselém prostředí se v procesu deamidace postupně oddělí všech 6 amidových skupin a elektroforetická a chromatografická mobilita změn inzulínu [40]. Tvorba deamidovaných forem inzulínu může být posouzena výsledky stanovení amoniaku. Pro plně amidovou formu inzulínu se stanoví 6 mol amoniaku na 1 mol bílkoviny, u deamidovaných forem může být tato hodnota 5 až 0.

Primární struktura inzulinu. Primární struktura inzulínu byla v letech 1945-1955 rozdělena skupinou Sanger. Použitím řady chromatografických metod, které umožnily oddělit a identifikovat různé peptidy, aminokyseliny a jejich deriváty, byl Sanger schopen stanovit primární strukturu bovinního inzulínu [130,131,132,133,134,135]. Další studie inzulinů různých původů za použití různých fyzikálně chemických metod, včetně Edmanovy metody pro stanovení úplné aminokyselinové sekvence v dlouhých peptidech, potvrdila zjištění Sangera a jeho spoluautorů o struktuře inzulinu [bb].

Dosud byla primární struktura inzulínu určena zástupci 24 druhů, které patří do 4 tříd zvířat: savci, ptáci, ryby a cyklostomy [14]. Výzkum inzulínu různého původu pokračuje [71,72,73].

Struktura inzulinu u různých zvířat je podobná, ale ne totožná. Ve své primární struktuře je lidský inzulín podobný vepřům, psům, spermií a králičím inzulínům, lišící se pouze v jedné aminokyselině [40]. To se liší od dobytek inzulínu třemi aminokyselinami. Ve větším rozsahu není lidský inzulín podobný inzulínu guinejského prasete, ptáků a ryb [40]. Rozdíly v aminokyselinové sekvenci lidských, prasečích a hovězích inzulínů jsou uvedeny v tabulce 3.

Navzdory strukturálním rozdílům mají všechny typy inzulínů podobnou biologickou aktivitu, tj. hypoglykemický účinek. Avšak hodnota vykazovala biologickou účinnost silně závisí na druhu rostlin, a je v rozmezí od 11 IU / mg (v Severním moři inzulínu COD) a 62 IU / mg (inzulín krůtí a kuřecí), ve kterém je činnost lidského inzulínu je v řádu 25-30 IU / mg [40]. Čím větší rozdíly mezi jednotlivými druhy, tím větší je rozdíl v biologické aktivitě odpovídajícího inzulínu.

Funkčně aktivní molekula inzulínu sestává ze dvou polypeptidových řetězců (řetězců A a B) spojených disulfidovými vazbami; jedna vazba je tvořena sedmými aminokyselinovými zbytky obou řetězců, druhá disulfidová vazba je tvořena 20. zbytkem A-řetězce a 19. zbytkem B-řetězce (obr. 2). Kromě toho existuje třetí disulfidová vazba v molekule inzulínu, která je intrachain a spojuje 6. a 11. rezidua řetězce A [59, 117].

Sekundární struktura Při použití různých metod fyzikálně chemických a fyzikálních výzkumů se ukázalo, že molekula inzulínu má velmi uspořádanou prostorovou strukturu (konformaci), která přispívá k realizaci specifických biologických funkcí [14]. V molekule nativního inzulínu jsou přítomny současně krycí vrstvy cc-helix a p-fold. Kromě toho existují oblasti s neuspořádanou strukturou a strukturou <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Když se kyselý roztok inzulínu (pH 2,3-2,5) zahřeje na teplotu +100 ° C a rychle se ochladí na -80 ° C, vytvoří se tzv. Fibrilární inzulín - zcela neaktivní forma hormonu [27]. Zavedení fibrilárních inzulinových vláken do roztoku aktivního inzulínu způsobuje spontánní kvantitativní srážení inzulínu ve formě fibril [14,17].

Výrobní metody, standardizace a kontrola kvality inzulinových přípravků

Získání druhů zvířecích inzulínů. Průmyslová výroba hovězího a vepřového inzulínu byla zavedena téměř současně v řadě zemí, krátce po objevení inzulínu v roce 1921 [63]. Od té doby se koncept získání inzulínu prakticky nezměnil (tabulka b) [17, 18]. Surovinami pro výrobu živočišných druhů inzulínu jsou pankreas jatečného skotu používaného v potravinách.

Nejdůležitějším úkolem při výrobě inzulinu je jeho čištění - uvolňování látek ze souvisejících nečistot, které snižují biologickou aktivitu, způsobují imunologické reakce nebo jsou potenciálně nebezpečné pro zdraví pacienta. Například po několika letech použití špatně purifikovaného inzulínu v krvi pacienta může být až 5 000 IU inzulínu vázaných na protilátky. Protilátky proti inzulínu významně ovlivňují profil jeho působení a tím přispívají k nestálému průběhu diabetu.

První způsob čištění inzulinu byl rekrystalizace v přítomnosti zinečnatých solí. V roce 1945 bylo prokázáno, že sedmnásobná rekrystalizace inzulínu významně snižuje hladinu alergických reakcí u pacientů ve srovnání s inzulínovými přípravky, které byly v té době oficiální [63].

protiproudé extrakce (PE), rozdělovači chromatografie (PX), iontoměničovou chromatografií (MOV) diskelek-troforeza (DEF), a vyloučení chromatografie na silikagelu (GEH) [63] za použití počtu vzorků metody heterogenity inzulínu po krystalizaci a jediný krystalizace ukazuje.

Bylo zjištěno, že hlavní nečistoty jsou současně inzulín: proinzulin, jejich meziproduktů, kovalentní dimer inzulínu, monodezamidoinsulin a monoarginin monoetilinsulin, stejně jako množství vysokomolekulárních sloučenin nejsou přirozené inzulín. Generalizované závěry studií, přičemž v úvahu informace o imunologické aktivity detekovány nečistoty [138], závěr byl potřeba dalšího čištění inzulínu látek, tak, že analytické metody a DEF GEH detekován jednu složku - odpovídající inzulin.

Pro řešení problému čištění inzulinu v roce 1950 byla navržena metoda HEC a v roce 1970 metoda aniontoměničové chromatografie (AOX). Bylo zjištěno, že inzulin purifikovaný metodou AOX obsahuje asi 500 ppm nečistot s proinzulinovou aktivitou [137]. Další čištění inzulinu pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie na obrácených fázích (RP HPLC) snižuje obsah imunogenních frakcí na hranici jejich detekce [63].

Přehled současného vývoje v oblasti chromatografického čištění inzulinu je uveden v [96]. Inzulin, purifikovaný postupně za použití IOC a GEC, se nazývá monokomponentní inzulín [63]. Získání lidského inzulínu. Vyhledávání metod získávání lidského inzulínu bylo způsobeno dvěma okolnostmi. Na jedné straně naléhavost problému surovin v případě výroby zvířecího inzulínu, na druhé straně rychlý rozvoj vědy v této oblasti poskytl skutečnou příležitost k uvedení myšlenky do života. V letech 1979 a 1981 téměř současně byly vyvinuty dva způsoby získání lidského inzulínu - biosyntetické a polosyntetické [102, 108]. V roce 1981 společnost Novo Nordisk poprvé na světě zahájila sériovou výrobu lidského polosyntetického inzulínu. Metoda použitá společností je založena na enzymatické a chemické náhradě Al v molekule prasečího inzulínu se zbytkem Tre [61]. Tato metoda je přímo závislá na získání požadovaného množství prasečího inzulínu, což snižuje jeho ekonomickou hodnotu. Možnost získání lidského inzulínu biosyntetickou metodou se objevila při vývoji technologie rekombinantní DNA [10]. Práce na geneticky modifikovaném výrobě inzulínu začaly asi před 25 lety. V roce 1978 bylo zjištěno, že byl získán kmen E. coli produkující krysí proinfekci. V roce 1979 byly studie společnosti Genentech schopny klonovat do E. coli geny kódující aminokyselinové sekvence. inzulínových řetězců A a B obsažených v p-halo-tacidázové oblasti plazmidu pBR322 [10, 102]. V roce 1981 se syntetizuje proinzulinový gen analog - mini-proinzulin-C, kde se 35-ulcerózní segmentu C-peptid nahrazen šesti aminokyselin: Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg a ukazuje jeho expresi v E. coli. V roce 1982 společnost Eli Lilly zahájení komerční produkce lidského inzulínu ve světově první ze dvou řetězce technologie vyvinutá ve spolupráci s firmou Genentech [102]. V současnosti je prokázána možnost získání lidského inzulínu pomocí různých expresních systémů [3,10,101,102]. Z ekonomického hlediska zvláštního zájmu je použití geneticky upravených E.coli kmeny gram-pozitivní bakterie, z nichž mnohé jsou považovány za superproducer [3]. Ve stejné době, významný pokrok byl učiněn kvasinkových buněk Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabulka 7 uvádí klíčem společné pro různé způsoby produkce rekombinantních lidských kroky inzulínu procesu [3,10,63].

Aplikace vyvinuté metodiky pro testování oficiálních inzulinových přípravků

Vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) je variantou sloupcové kapalinové chromatografie, při které mobilní fáze - eluent - prochází sorbentem, který vyplňuje kolonu vysokou rychlostí kvůli významnému tlaku (až 400 x 105 Pa) na vstupu do sloupce [11].

Jako způsob analýzy komplexních směsí látek se HPLC ukázala před více než třiceti lety. Použití sorbentů s průměrem částic 3 až 10 um způsobilo prudké zvýšení účinnosti chromatografické separace ve srovnání s klasickou verzí sloupcové kapalinové chromatografie. Proto se HPLC často označuje jako vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Instrumentální vlastnosti použití HPLC jsou podrobně popsány v četných manuálech [49.50] a v příslušných částech vedoucího lékopisu [79, 150]. Pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii bylo vyvinuto a vyrábí se široká škála sorbentů. Podle autorů průzkumu [51] - asi 100 firem po celém světě vyrábí více než 300 druhů sorbentů. Historie, současný stav a vyhlídky na vývoj metody jsou diskutovány v recenzích [51] a [77.78].

Ve svých různých variantách se metoda HPLC široce používá ve farmaceutické analýze (kontrola výroby a testování kvality léčiva). Metoda je zahrnuta ve všech hlavních lékopisech světa. Tato metoda je nejlépe popsána v evropských a amerických lékopisech. HPLC se používá k identifikaci léčiv, k určení čistoty, molekulové hmotnosti frakční kompozice a kvantitativní analýzy. V US Pharmacopoeia 28 ed. asi 30% soukromých článků zahrnuje použití HPLC. V evropském lékopise 4. ed. toto číslo je asi 40%.

První chromatografickou metodou pro testování inzulínem byla nízkotlaká gelová chromatografie (GE ZhND). Princip separace za podmínek HPLC je založen na odlišné schopnosti molekul různých velikostí pronikat do pórů neutrálního gelu, který slouží jako stacionární fáze. Hydrodynamický průměr monomeru inzulínu a dimeru je úměrný jejich molekulové hmotnosti a je 2,69 a 5,50 nm [115].

V roce 1967 se pomocí metody GE-IHDD ukázalo, že komerční přípravky inzulinu, čištěné krystalizací, obsahují nečistoty s molekulovou hmotností přesahující molekulovou hmotnost inzulínu [63]. Na chromatogramech prasečího inzulínu byly nalezeny tři píky, konvenčně označované jako a-, b- a c-složky. Od té doby bylo navrženo množství chromatografických systémů pro kontrolu obsahu nečistot s vysokou molekulovou hmotností v inzulínových přípravcích. Separace se provádí na silně bobtnající xerogely agarosy (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Nebo dextran (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals), byl použit jako řešení PD 1-3 M kyseliny octové [127]. Vysoká citlivost těchto sorbentů na kompresi při tlacích přesahujících tlak bobtnání matrice činí tyto materiály nevhodnými pro provoz v režimu HPLC.

Použití kapalinové chromatografie s vyloučením gelu při vysokých tlacích (GE HPLC) pro analýzu inzulínu bylo poprvé popsáno v roce 1980 po vývoji tvrdých makroporézních sorbentů kompatibilních s vodou a odolných vysokým tlakům. V [151] Separace se provede na sloupci Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-gel SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) za denaturačních podmínek (7 M močoviny směsi roztoku minerálních kyselin nebo iontu detergenty). Potřeba inzulínové analýzy za denaturačních podmínek je spojena se schopností inzulinu agregovat v roztoku. Pro oddělení inzulínu za podmínek HPLC HPLC bylo také popsáno použití "tradičního" elučního činidla kyseliny octové [152]. Použití kyseliny octové má několik výhod - minimální dopad na přirozenou strukturu oddělených sloučenin, dostupnost, nízké náklady, navíc důležitou skutečností je schopnost kyseliny octové potlačovat asociaci inzulínu.

V současné době HPLC ghvd je lékopisná metoda pro sledování obsahu vysokomolekulárních nečistot v látkách a hotových dávkových formách. Tato metoda se také používá k určení obsahu protaminu v přípravcích na bázi isofanu a inzulínu.

Použití HPLC na reverzních fázích (RP HPLC) pro oddělení dobytek a prasečího inzulínu poprvé ukázalo vysokou účinnost této metody pro analýzu peptidů podobných inzulínu s podobnou strukturou.

Mechanismus separace proteinů a polypeptidů za podmínek RP HPLC je založen na různé hydrofobnosti molekul inzulínu a příbuzných nečistot. Dosud bylo popsáno několik desítek metod pro chromatografické oddělení inzulínu různého původu a jejich derivátů, včetně proin-sulinu, pankreatických polypeptidů, dezamido derivátů, dimeru inzulínu. [126] ukázala možnost oddělení kuřat, králíka, ovcí a koňského inzulínu. Lidský, hovězí a vepřový inzulin byl také oddělen. Lloyd a Corran publikovali metodu oddělení hovězího, vepřového, lidského inzulínu a odpovídajících deamidovaných forem [104].

Separace se provádí na modifikovaných silikagelových sorbentech, methylových, butylových, oktylových, oktadecylových a fenylových skupinách v isokratickém nebo gradientním módu. Jako PF se používají organické modifikátory - acetonitril, methylalkohol, isopropylalkohol, smíchané s vodnými pufrovými roztoky obsahujícími anorganické soli a iontové páry. Detekce špiček se provádí hlavně spektrofotometrickou metodou při vlnové délce 190-220 nm, jsou také popsány fluorimetrické metody [103].

Analýza látky a hotových dávkových forem inzulinu pomocí RP HPLC je popsána v soukromých článcích v Americkém a Evropském lékopisu [79, 150]. Metoda se používá k testování léků specifické skupiny z hlediska "autenticity inzulínu", "souvisejících proteinů", "kvantitativního stanovení" a "inzulínu v roztoku".

Vědecká literatura také popisuje použití iontoměničové a afinitní chromatografie pro inzulínovou analýzu [44, 102], avšak tyto metody nebyly široce používány v lékopisné praxi.

Výběr podmínek pro chromatografické stanovení protaminu v dávkových formách isofan-inzulinu

Zvýšené ion PF síly obvykle vede ke zvýšení součinitele inzulínu kapacity, která může být způsobeno řadou faktorů: - koncentrace zvýšení iontů snižuje stupeň ionizace nabitých skupin molekuly proteinu, čímž se zvyšuje její hydrofobnosti / - vysoká koncentrace kationtu přispívá ke stínění volných silanolových skupin na povrchu stacionární fázi, která oslabuje nespecifickou elektrostatickou interakci protonovaných aminoskupin proteinu s matricí; - vysoká iontová síla ovlivňuje prostorovou strukturu inzulínu, v důsledku čehož se mění povrch dostupný pro interakci se sorbentem. Koncentrace anorganických solí v FS ovlivňuje tvar píků a selektivitu oddělení inzulínu a desamido-Asn-inzulinu [143, 144]. Při isokratická eluce na sorbentu LiChrosorb Sіv 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 2,3), uspokojivého výsledku bylo dosaženo pouze přidání síranu sodného do roztoku pufru na koncentraci 0,1 M. Většina technik analýzy inzulín součástí lékopisné monografií a ND použijte PF na bázi pufrů s obsahem síranu sodného 0,2 M. Takový vysoký obsah síranu sodného negativně ovlivňuje reprodukovatelnost výsledků chromatografie v důsledku stratifikace eluentů, vysoce koncentrované solné roztoky mají negativní vliv na chromatografické zařízení, což zkracuje jejich životnost. Vzhledem k tomu, že lékopisné metody analýzy byly vyvinuty před více než 20 lety, bylo zajímavé studovat chromatografické chování inzulinu pod OF-HPLC na chromatografických sorbentech poslední generace v závislosti na koncentraci síranu sodného. Současně se pokoušeli zjistit, zda je přípustné snížení obsahu síranu sodného v PF bez významného zhoršení schopnosti separace chromatografického systému. Výsledkem výzkumu bylo zjištění, že účinek koncentrace síranu sodného v PF je různý, v závislosti na typu roubované kůry, stejně jako na druhu inzulinu. Na sorbentech s roubovanými skupinami C4 a C selektivita oddělení vrcholů lidského inzulínu a desamido-Asn-lidského inzulínu není závislá na koncentraci síranu sodného. roztoku pufru v rozmezí od 0,05 M do 0,2 M. Na sorpentu Diaspher-110-C18 má separační selektivita tohoto páru píků maximální hodnotu 0,05 M a minimální hodnotu 0,1 M (graf 4). Na druhou stranu selektivita oddělování živočišných druhů inzulinu a jejich odpovídající desamidované formy AsnA21 nezávisí na iontové síle roztoku, když se oddělí na sorbentu Diaspher-110-C18. Na sorbentu s roubovanými skupinami C8 se selektivita zvyšuje z 1,25 na 1,28 se zvýšením koncentrace síranu sodného (obrázek 4). Na sorbentu roubované skupiny C4 selektivity separace v případě hovězího inzulínu maximální, když byla zjištěna 0,1 M síranu sodného a minimální na 0,2 M. Za vepřového insulinu výrazné maximum při koncentraci síranu sodného 0,1 M, v tomto případě zvýšení iontové sily vedly ke snížení selektivity oddělení (obr. 4). Počet účinných teoretických desek se zvyšuje s rostoucí koncentrací síranu sodného. Výjimkou je chování lidského inzulínu na sorbentu Diasfer-110-C8 (obrázek 5). Stupeň oddělení vrcholů inzulínu a desamido-Asn-inzulinu se zvyšuje se zvýšením iontové síly FS bez ohledu na druh inzulinu a typ transplantované fáze (schéma b). Snížením koncentrace síranu sodného z 0,2 M na 0,1 M se stupeň oddělení vybraných dvojic vrcholů sníží v průměru o 5% u lidských a prasečích inzulínů a o 10% u hovězího inzulínu. Vzhledem k tomu, že absolutní hodnota stupně separace přesahuje 2,0, není naměřené zhoršení separační kapacity sloupce podle našeho názoru významné. V důsledku toho může být koncentrace síranu sodného v pufrovacím roztoku PF redukována dvakrát ve srovnání s farmakologickými metodami analýzy.

Ve většině studií o analýze proteinů a peptidů se dělení provádí při pokojové teplotě. Navíc někteří autoři naznačují, že vliv teploty na selektivitu separace je minimální [48]. Avšak se zvyšující se teplotou se proces hromadné výměny mezi stacionární a mobilní fází zrychluje, což vede k poklesu retenčního času peptidů a zúžení píků.

Inzulínová technologie

Porušení sekrece inzulínu. Použití affiliate photography. Schéma inzulinu. Exprese proinzulinu v buňkách E. coli. Přístupy k řešení problému s diabetem. Příspěvek biotechnologie k průmyslové výrobě nepeptidových hormonů.

Vaše dobrá práce v znalostní bázi je jednoduchá. Použijte níže uvedený formulář.

Studenti, postgraduální studenti, mladí vědci, kteří používají znalostní bázi při studiu a práci, vám budou velmi vděční.

Publikováno dne http://www.allbest.ru/

Publikováno dne http://www.allbest.ru/

Publikováno dne http://www.allbest.ru/

MINISTERSTVO VZDĚLÁVÁNÍ A VĚD KAZACHSTANSKÉ REPUBLIKY

KAZAKH AGRO-TECHNICKÁ UNIVERZITA NÁMĚNA PO S.SEYFULLINU

Oddělení mikrobiologie a biotechnologie

Na obor "Biotechnologie mokroorganizmov"

Na téma: technologie pro inzulín

Dokončeno: Myrzabek M? Lir Kurbanbek? Yzy

Zkontrolováno: Akimbaeva A.K. (k B. N)

ZKRATKY A SYMBOLY

1. Historie objevu

2. Získání inzulínu v biotechnologii

3. Způsoby získání lidského inzulínu

4. Exprese proinzulinu v buňkách E. coli

5. Purifikace inzulinu

6. Dávkování a podání

V tomto kurzu práce použila následující definice:

Proteinový nosič - zajišťující transport hybridního proteinu v periplazmatickém prostoru buňky nebo kultivačního média;

Součást afinity - významně usnadňuje výběr hybridního proteinu.

Inzulín (z latinského insula -. Island) - peptidového hormonu, je produkován v beta buňkách Langerhansových ostrůvků slinivky břišní.

Interleukiny jsou skupinou cytokinů syntetizovaných hlavně leukocyty (z tohoto důvodu byl vybrán koncový "-leukin").

Proinzulin je prekurzor inzulínu syntetizovaného B buňkami insulárního aparátu pankreatu.

Chromatografie (z řečtiny, chroma, chromatografie - barva, barva), fyzikálně chemická metoda separace a analýzy směsí založená na distribuci jejich složek mezi oběma fázemi - stacionární a mobilní (eluent), protékající stacionárními.

Zapouzdření - mechanismus programovacího jazyka, který omezuje přístup ke komponentům, které tvoří objekt (metody a vlastnosti), je soukromý, tj. Přístupný pouze v rámci objektu.

Fúzní protein (fúzní protein, také chimérní složený protein) je protein získaný kombinací dvou nebo více genů, které původně kódovaly oddělené proteiny.

Hormony (z řečtiny Hormao - uvedou do pohybu, indukují), hormony, biologicky aktivní látky produkované endokrinními žlázami nebo endokrinními žlázami a vylučované přímo do krve.

Diabetes mellitus je skupina endokrinních onemocnění, která vzniká jako výsledek absolutní nebo relativní nedostatečnosti hormonálního inzulínu.

Zapouzdření - mechanismus programovacího jazyka, který omezuje přístup ke komponentům, které tvoří objekt (metody a vlastnosti), je soukromý, tj. Přístupný pouze v rámci objektu.

Somatostatin je hormon deltových buněk pankreatických ostrovů Langerhans, stejně jako jeden z hormonů hypotalamu.

Radioimunitní analýza je metoda pro kvantitativní stanovení biologicky aktivních látek (hormonů, enzymů, léčiv atd.) V biologických tekutinách na základě kompetitivní vazby požadovaných stabilních a podobných radioaktivně značených látek se specifickými vazebnými systémy.

ZKRATKY A SYMBOLY

HPLC - vysoce výkonná kapalinová chromatografie

cDNA - komplementární deoxyribonukleová kyselina

Hlavní funkcí inzulínu je zajistit propustnost buněčných membrán pro molekuly glukózy. Ve zjednodušené formě lze říci, že nejen sacharidy, ale také veškeré živiny jsou nakonec rozděleny na glukózu, která se používá k syntéze dalších molekul obsahujících uhlík, a je jediným typem paliva pro buněčné elektrárny - mitochondrie. Bez inzulínu propustnost buněčné membrány na glukózu klesá 20krát a buňky umírají z hladovění a přebytečný cukr rozpuštěný v krvi jede tělo.

Porušení sekrece inzulínu v důsledku destrukce beta buněk - absolutního nedostatku inzulínu - je klíčovou složkou patogenezi diabetu 1. typu. Porušení účinku inzulínu na tkáň - relativní nedostatek inzulínu - má důležité místo ve vývoji diabetu 2. typu.

Použití afinitní chromatografie významně snižuje obsah kontaminujících proteinů v přípravku s vyšší molekulovou hmotností než inzulín. Takové proteiny zahrnují proinzulin a částečně štěpené proinsuliny, které jsou schopné indukovat produkci antiinzulinových protilátek.

Použití lidského inzulínu od samého začátku léčby minimalizuje výskyt alergických reakcí. Lidský inzulín se vstřebává rychleji a bez ohledu na formu léčiva má kratší dobu působení než zvířecí inzulín. Lidské inzulíny jsou méně imunogenní než vepřové, zvláště smíšené bovinní a prasečí inzulíny.

Účelem této práce je studium technologie inzulínu. K dosažení těchto cílů bylo stanoveno:

1. získání inzulínu v biotechnologii

2. Způsoby, jak dostat inzulin

H. Purifikace inzulínu

Historie objevu inzulínu je spojena s názvem ruského lékaře I.M. Sobolev (druhá polovina 19. století), který dokázal, že hladina cukru v lidské krvi je regulována zvláštním hormonem pankreatu.

V roce 1922 byl poprvé představen inzulínu izolovanému z pankreatu zvířete desetiletému chlapci, diabetický pacient překonal všechna očekávání a o rok později vydala americká společnost Eli Lilly první živočišný inzulínový přípravek.

Po příjmu první průmyslové dávky inzulínu v příštích několika letech byla překročena obrovská cesta izolace a čištění. Výsledkem je, že hormon byl dostupný u pacientů s diabetem 1. typu.

V roce 1935 dánský badatel Hagedorn optimalizoval působení inzulínu v těle navržením prodlouženého léku.

První krystaly inzulínu byly získány v roce 1952 a v roce 1954 rozluštil anglický biochemik G. Senger strukturu inzulínu. Vývoj metod pro čištění hormonu od jiných hormonálních látek a produktů degradace inzulínu umožnil získat homogenní inzulín, nazývaný jednozložkový inzulín.

Na počátku 70. let. Sovětské vědci a S. A. Yudaev Shvachkin bylo navrženo chemickou syntézu inzulínu, ale realizace syntézy v průmyslovém měřítku byla drahá a neekonomické.

V budoucnu dochází k postupnému zlepšení stupně čištění inzulínů, což snižuje problémy způsobené alergiemi na inzulín, poruchou funkce ledvin, poruchou zraku a odolností proti imunitní inzulínu. Nejúčinnějším hormonem bylo potřeba substituční léčby u diabetes mellitus - homologního inzulínu, tj. Lidského inzulínu.

V osmdesátých letech pokročilo v molekulární biologii syntetizovat lidské inzulínové řetězce za použití E.coli, které byly poté spojeny do molekuly biologicky aktivního hormonu a rekombinantní inzulín byl získán u Ústavu bioorganické chemie ruské akademie věd za použití kmenů E.coli geneticky upravených.

2. Získání inzulínu v biotechnologii

Inzulin, peptidový hormon pankreatických ostrovů Langerhans, je hlavní léčbou diabetes mellitus. Toto onemocnění je způsobeno nedostatkem inzulínu a projevuje se zvýšením hladiny glukózy v krvi. Až donedávna byl získán inzulín z pankreatu býka a prasete. Látka se lišila od substitucí lidského inzulínu s 1-3 aminokyselinami, takže hrozila alergická reakce, zejména u dětí. Velké léčebné využití inzulínu bylo omezeno vysokými náklady a omezenými zdroji. Chemická modifikace inzulínu ze zvířat byla dělána nerozlišitelná od člověka, ale to znamenalo další zvýšení nákladů na výrobek. [1]

Od roku 1982 produkuje Eli Lilly geneticky upravený inzulin založený na samostatné syntéze řetězců E. coli a B. Náklady na výrobek výrazně poklesly, produkovaný inzulin je identický s lidským. Od roku 1980 se v tisku objevují zprávy o klonování proinzulinového genu, prekurzoru hormonu, který prochází do zralé formy s omezenou proteolýzou.

Technologie zapouzdření je také spojena s léčbou cukrovky: pankreatické buňky v kapsli, zavedené jednou do těla pacienta, produkují inzulin během jednoho roku.

Integrovaná genetika zahájila produkci folikuly stimulujících a luteinizačních hormonů. Tyto peptidy jsou složeny ze dvou podjednotek. Na pořadu jednání je otázka průmyslové syntézy oligopeptidových hormonů nervového systému, ankefalinů postavených z 5 aminokyselinových zbytků a endorfinů, morfinových analogů. Při racionálním užití těchto peptidů ulehčuje bolest, vytváří dobrou náladu, zvyšuje účinnost, soustřeďuje pozornost, zlepšuje paměť, ukládá spánek a bdění. Příkladem úspěšné aplikace metod genetického inženýrství je syntéza β-endorfinu za použití technologie hybridních proteinů popsané výše pro další peptidový hormon, somatostatin [2].

3. Způsoby získání lidského inzulínu

Historicky první cestou k získání inzulínu pro terapeutické účely je izolace analogů tohoto hormonu z přírodních zdrojů (pankreatické ostrovce skotu a prasat). Ve 20. letech minulého století bylo zjištěno, že bovinní a prasečí inzulíny (které jsou v struktuře a sekvenci aminokyselin nejblíže lidskému inzulínu) vykazují aktivitu v lidském těle, která je srovnatelná s lidským inzulínem. Poté se bovinní nebo prasečí inzulín dlouhodobě používá k léčbě pacientů s diabetem 1. typu. Po určité době se však ukázalo, že v některých případech se v lidském těle začínají hromadit protilátky proti bovinním a vepřovým inzulínům, a tím zničí jejich účinky.

Na druhou stranu jednou z výhod této metody získání inzulínu je dostupnost surovin (ve velkém množství lze snadno získat bovinní a vepřový inzulín), který hrál rozhodující úlohu při vývoji první metody získání lidského inzulínu. Tato metoda se nazývá polosyntetická [3].

Při tomto způsobu výroby lidského inzulínu byl jako surovina použit prasečí inzulín. Z purifikovaný prasečí inzulín štěpí C-terminální oktapeptid B-řetězce byl syntetizován a pak se C-terminální oktapeptid lidský inzulín. Pak byla chemicky připojena, ochranné skupiny byly odstraněny a získaný inzulin byl čištěn. Při testování tohoto způsobu získání inzulínu byla ukázána úplná identita hormonu získaného z lidského inzulínu. Hlavní nevýhodou této metody je vysoká cena výsledného inzulínu (i nyní je chemická syntéza oktapeptidu drahá, zejména v průmyslovém měřítku).

V současné době se lidský inzulín získává hlavně dvěma způsoby: modifikací vepřového inzulínu syntetickou enzymatickou metodou a metodou genetického inženýrství.

V prvním případě je metoda založena na skutečnosti, že prasečí inzulín se liší od lidského inzulínu jedinou substiticí na C-konci Ala30Thr B-řetězce. Nahrazení alaninu treoninem se provádí štěpením alaninu katalyzovaným enzymem a namísto toho se přichycuje treoninový zbytek chráněný karboxylovou skupinou přítomný v reakční směsi ve velkém přebytku. Po odštěpení ochranné O-terc-butylové skupiny se získá lidský inzulín. (obrázek 1)

Obrázek 1 - Schéma metod pro výrobu lidského inzulínu

Inzulin byl první protein získaný pro komerční účely za použití technologie rekombinantní DNA. Existují dva hlavní přístupy k získání geneticky modifikovaného lidského inzulínu. V prvním případě produkují oddělené (různé kmeny producentů) oba řetězce, po nichž následuje skládání molekuly (tvorba disulfidových můstků) a oddělení misoformu. Ve druhém případě přípravu ve formě prekurzoru (proinzulinu), po němž následuje enzymatické štěpení trypsinem a karboxypeptidázou. Do aktivní formy hormonu. Nejvýhodnější je v současné době výroba inzulínu jako prekurzoru, který zajišťuje správné uzavření disulfidových můstků (v případě samostatné výroby řetězů, následné cykly denaturace, separace misoformu a renaturace jsou prováděny [3].

V obou přístupech je možné jak individuálně získat výchozí složky (řetězce A a B, tak proinzulin) a jako součást hybridních proteinů. Vedle A- a B-řetězců nebo proinzulinu může být přítomno v kompozici hybridních proteinů:

1) nosičový protein - zajištění transportu hybridního proteinu do periplazmatického prostoru buňky nebo kultivačního média;

2) afinitní složka - významně usnadňuje výběr hybridního proteinu.

Současně obě složky mohou být současně přítomny v kompozici hybridního proteinu. Navíc při vytváření hybridních proteinů lze použít princip multidimenzionality (tj. Několik kopií cílového polypeptidu je přítomen v hybridním proteinu), což umožňuje významně zvýšit výtěžnost cílového produktu [4].

Použili jsme kmen JM 109 N1864 s nukleotidovou sekvencí vloženou do plazmidu exprimujícího hybridní protein, který se skládá z lineárního proinzulinu a fragmentu fragmentu proteinu Astaphylococcus aureus připojeného k jeho N-konci přes metioninový zbytek. Kultivace nasycené biomasy buněk rekombinantního kmene zajišťuje zahájení výroby hybridního proteinu, jehož izolace a sekvenční transformace intubací vede k inzulínu. Další skupina výzkumníků obdržela v bakteriálním expresním systému fúzní rekombinantní protein sestávající z lidského proinzulinu a polyhistidinového ocasu, který byl k němu připojen přes metioninový zbytek. Byla izolována chelátovou chromatografií na kolonách Ni-agarosy z inkluzních tělísek a byla trávena bromidem kyanogenu. Autoři zjistili, že izolovaný protein je S-sulfurizován. Analýza mapování a hmotnostní spektrometrie získaného proinzulinu, purifikovaná iontoměničovou chromatografií na aniontoměniči a RP (reverzní fáze) HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) ukázala přítomnost disulfidových můstků odpovídající disulfidovým mostům nativního lidského proinzulinu. Také informoval o vývoji nové, zdokonalené metody získání lidského inzulínu metodami genetického inženýrství v prokaryotických buňkách. Autoři zjistili, že získaný inzulin ve své struktuře a biologické aktivitě je identický s hormonem izolovaným ze slinivky břišní [5].

Nedávno byla věnována velká pozornost zjednodušení postupu výroby rekombinantního inzulínu metodami genetického inženýrství. Takže fúzní protein tvořený interleukinovým vedoucím peptidem připojeným k N-koncovému konci proinzulinu byl získán přes lyzinový zbytek. Protein byl účinně exprimován a lokalizován v inkluzních tělesech. Po izolaci byl protein štěpen trypsinem za vzniku inzulínu a C-peptidu. Další skupina výzkumníků jednal podobným způsobem. Fúzní protein sestávající z proinzulinu a dvou syntetických domén Staphylococcus protein A, které váží IgG, byl lokalizován v inkluzních tělesech, ale měl vyšší úroveň exprese. Protein byl izolován afinitní chromatografií s použitím IgG a ošetřen trypsinem a karboxypeptidázou B. Výsledný inzulin a C-peptid byly čištěny RP-HPLC. Při vytváření fúzních struktur je hmotnostní poměr nosného proteinu k cílovému polypeptidu velmi významný. Tak je popsán návrh fúzních konstruktů, kde byl jako nosný polypeptid použit protein, který váže lidský sérový albumin. Jeden, tři a sedm C-peptidů byl připojen k němu. C-peptidy byly kombinovány na bázi konce hlavy s použitím aminokyselinových distančních jednotek nesoucích restrikční místo Sfi I a dva argininové zbytky na začátku a na konci distanční části pro následné štěpení proteinu trypsinem. HPLC produkty štěpení ukázaly, že C-peptid je kvantitativně štěpen a to umožňuje použití metody multimerních syntetických genů k produkci cílových polypeptidů v průmyslovém měřítku.

Získání mutantního proinzulinu, který obsahoval náhradu Arg32Tyr. Při štěpení tohoto proteinu štěpením trypsinem a karboxypeptidázou B se vytvořil nativní inzulin a C-peptid obsahující tyrosinový zbytek. Ten se po značení 125I aktivně používá v radioimunoanalýze [6].

Kontrola kvality inzulínu

Obsah

1. Obecné informace o přípravě inzulinu 5

2. Metody používané pro kontrolu kvality inzulinu 8

Odkazy 17

Výňatek z práce

1-2% evropské populace trpí cukrovkou a asi 20% těchto pacientů nemůže existovat bez injekcí inzulínu. Od prvních pokusů o použití inzulinu pro léčbu diabetu v roce 1922 byl tento hormon izolován z pankreasu zvířat (krávy a prasata). Zvířecí inzulín je poněkud odlišný v aminokyselinové sekvenci od lidského inzulínu.

Lidské a vepřové inzulíny jsou zvláště blízké: u prasečího inzulínu je C-terminální threonin B-řetězce nahrazen alaninem. Krávy a lidský inzulín se liší ve třech aminokyselinových zbytcích. Tyto rozdíly určovaly zvýšenou imunogenní aktivitu bovinního inzulínu ve srovnání s prasečím inzulínem.

Téměř všichni pacienti, kteří byli léčeni krávou inzulínem, měli protilátky proti inzulínu v krvi. Antigenní vlastnosti inzulínu byly také částečně určeny nečistotami v jeho přípravcích. S největší pravděpodobností se jednalo o tvorbu protilátek proti inzulínu, které vysvětlovaly některé vedlejší účinky při injekčním podání inzulínu, například atrofii podkožního tuku v místě opětovného podání injekce. V případě vysoce purifikovaného inzulínu tyto účinky chyběly.

Následně díky genetickému inženýrství a použití E. coli byl získán lidský inzulín.

Lidský inzulín, získaný z E. coli, byl prvním "geneticky upraveným" proteinem testovaným u lidí. Při pokusech se zdravými dobrovolníky bylo zjištěno, že je bezpečné (nezpůsobuje alergické a jiné nežádoucí reakce) a má schopnost snížit hladinu glukózy v krvi podávanou pod kůží nebo intravenózně.

V současné době je takový lidský inzulín dosažen mnoha diabetiky po celém světě. Toto předcházely klinické studie, ve kterých byly studovány metabolické změny a imunologické účinky.

Důležitost našeho tématu spočívá v tom, že nekontrolovaná nebo špatně kontrolovaná produkce může vést k uvolnění kontaminovaných inzulinových přípravků, což může vést k nepříznivým klinickým následkům.

Cílem této práce je studium metod používaných při kontrole kvality inzulínu.

Odkazy

GOST R 52249-2004 "Pravidla pro výrobu a kontrolu kvality léčiv" 2004

OFS 42-0002-00 "Bakteriální endotoxiny" 2000

OFS 42-0126-09 "Biologické testování inzulínu"

Farmakologický článek Ruské federace FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Genetické inženýrství lidského inzulínu: úspěchy a vyhlídky // Ruský chemický časopis. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - str. 34-45.

Goncharenko G.G. Základy biotechnologie: Didaktická metoda. komplex pro stud.biolog. speciální / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min arr. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 stran.

Ryabko, Yu.S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Aplikace kineticko-chromogenní metody pro stanovení bakteriálního endotoxinu (test LAL) v technologii čištění geneticky modifikovaného lidského inzulínu // Biopharmaceutical journal - 2009. - svazek 1. - №1. - str. 34-37.